Während der Besetzung Roms durch die Nazis (11. September 1943 – 4. Juni 1944) wurde das Gefängnis Regina Coeli zu einem wichtigen Zentrum für die Unterdrückung, das zum Teil vom deutschen Kommando geleitet wurde, das den dritten und sechsten Flügel besetzte. In enger Verbindung mit der Via Tasso, dem Hauptquartier des SS-Kommandos und des Sicherheitsdienstes (SD), beherbergte Regina Coeli Gefangene, die von den Nazis und den Faschisten der Republik Salò verhaftet worden waren. Dabei handelte es sich oft um Mitglieder des Widerstands, Partisanen, politische Gegner, die der Aktionspartei (Partito d’azione), der Kommunistischen Partei oder den Christdemokraten angehörten, aber auch um Juden, Deserteure, Studenten, Priester und sogar Mütter und Väter.

Regina Coeli war nicht nur ein Ort von Haft und Folter, sondern auch ein Ausgangspunkt für die Deportation von politischen Gefangenen, antifaschistischen Juden und „unerwünschten Personen“. Viele Gefangene wurden in das Durchgangslager Fossoli überstellt, das Vorzimmer zur Deportation in Nazi-Lager wie Auschwitz, Mauthausen und Dachau gewesen ist, oder wurden direkt in Konzentrationslager verbracht, um dort eliminiert oder bei Zwangsarbeit ausgebeutet zu werden.

Das Gefängnis fungierte für viele Gefangene als Zwischen- oder Endstation: Diejenigen, die in der Via Tasso gefoltert worden waren, wurden nach Regina Coeli verlegt, wenn sie nicht mehr als nützlich für die Informationsbeschaffung angesehen wurden, oder Gefangene aus Regina Coeli wurden nach Via Tasso gebracht, wo sie verhört und oft gefoltert wurden. In anderen Fällen wurden sie von Regina Coeli vor Kriegsgericht gestellt, das sie zu einer Haftstrafe in Deutschland, zur Deportation in Lager oder zur Hinrichtung, oft in Forte Bravetta, verurteilte. Viele Gefangene endeten als Opfer in den Ardeatinischen Höhlen.

Die Lebensbedingungen waren extrem hart. Der sechste Flügel, der den politischen Gefangenen vorbehalten war, war durch Überbelegung, Nahrungsmittelknappheit und das Fehlen von Grundrechten geprägt. Die Zellen von Regina Coeli, die kurz vor dem Sturz Mussolinis faschistische Funktionäre beherbergt hatten, wurden zu einem Ort der Inhaftierung für diejenigen, die gegen den Nazifaschismus kämpften. Insgesamt passierten Tausende von Menschen das Gefängnis, was die Vielfalt der Opfer der Naziunterdrückung versinnbildlicht, von der Arbeiterklasse bis zur aristokratischen Elite.

Am 4. Juni 1944, mit dem Eintreffen der Alliierten, zogen sich die Nazis zurück und das Nationale Befreiungskomitee verfügte die sofortige Freilassung der politischen Gefangenen. Die römische Bevölkerung machte sich schnell daran, die verbliebenen Gefangenen zu befreien. Viele von ihnen sammelten Unterlagen aus dem Meldeamt der deutschen Einheit, bevor sie in die Freiheit zurückkehrten, wertvolle Beweise für die begangenen Gräueltaten. Regina Coeli ist zusammen mit der Via Tasso bis heute ein Symbol des Leidens, der Deportation und des Widerstands während der Besetzung Roms.